Evolution of equine influenza viruses (H3N8) during a Brazilian outbreak, 2015

Abstract Equine influenza is one of the major respiratory infectious diseases in horses. An equine influenza virus outbreak was identified in vaccinated and unvaccinated horses in a veterinary school hospital in São Paulo, SP, Brazil, in September 2015. The twelve equine influenza viruses isolated belonged to Florida Clade 1. The hemagglutinin and neuraminidase amino acid sequences were compared with the recent isolates from North and South America and the World Organisation for Animal Health recommended Florida Clade 1 vaccine strain. The hemagglutinin amino acid sequences had nine substitutions, compared with the vaccine strain. Two of them were in antigenic site A (A138S and G142R), one in antigenic site E (R62K) and another not in antigenic site (K304E). The four substitutions changed the hydrophobicity of hemagglutinin. Three distinct genetic variants were identified during the outbreak. Eleven variants were found in four quasispecies, which suggests the equine influenza virus evolved during the outbreak. The use of an out of date vaccine strain or updated vaccines without the production of protective antibody titers might be the major contributing factors on virus dissemination during this outbreak.

Circovírus suíno 2b: isolamento e taxa de mutação em linhagem de célula de macrófagos (J744) / Porcine circovirus 2b: isolations and mutation rate in J744 lineage macrophage cell

Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.(AU)

Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.(AU)

Circovírus suíno 2b: isolamento e taxa de mutação em linhagem de célula de macrófagos (J744) / Porcine circovirus 2b: isolations and mutation rate in J744 lineage macrophage cell

Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.

Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.

Influence of the inclusion of spray-dried animal plasma in weanling pigs' diet on porcine circovirus type 2 (PCV2) loads / Influência da inclusão do plasma sanguíneo na dieta de leitões desmamados sobre a carga viral de circovírus suíno tipo 2 (PCV2)

Spray-dried animal plasma (SDAP), a natural byproduct of the meatpacking industry, has been shown to have beneficial effects on growth and performance of weaned pigs. Porcine circovirus 2 (PCV2) is an important virus that is disseminated in the pork industry. Regardless of the studies evaluating the possible transmission of PCV2 through SDAP, there is no information about the effects of its inclusion in the PCV2 loads in natural infections. The present investigation evaluated the influence of dietary inclusion levels of SDAP in weanling pigs on PCV2 viremia and humoral immune response. Fifty-six weaned piglets were fed in a 2-period feeding program. Dietary treatments included 0%, 2%, 4% or 6% and 0%, 1%, 2% or 3% of SDAP during period 1 (14 to 28 days old) and 2 (29 to 42-days old), respectively. In period 3 (42 to 56 days old), all piglets received a SDAP-free diet. Serum samples were collected weekly and tested for PCV2 antibodies and DNA load. The results show that the concentration of 6% and 3% of SDAP on feed offered for pigs during period 1 and 2, respectively, may have decreased the PCV2 loads.(AU)

O plasma sanguíneo em pó (PSP), produto natural de indústria frigorífica, tem mostrado efeitos benéficos sobre o crescimento e desempenho de leitões desmamados precocemente. Atualmente, embora o circovírus suíno 2 (PCV2) tenha grande importância para a suinocultura, não há informações sobre o impacto do uso de PSP e a resposta imune ao PCV2 em infecções naturais. Este trabalho avaliou diferentes níveis de inclusão de PSP em dietas de leitões e as cargas virais de PCV2 correspondentes. Quatro níveis de inclusão de PSP foram testados em dois períodos consecutivos: 0, 2, 4 ou 6% durante o período 1 (14 aos 28 dias de idade) e 1, 2 ou 3% de PSP durante o período 2 (29 a 42 dias de idade). No período 3 (42 aos 56 dias de idade), todos os leitões foram alimentados com dieta isenta de PSP. Amostras de soro foram coletadas semanalmente e testadas para anticorpos anti-PCV2 e carga de DNA de PCV2. As concentrações de 6% e 3% de PSP fornecidas nas rações durante o período 1 e 2, respectivamente, influenciaram na carga viral de PCV2 de suínos naturalmente infectados.(AU)

A double-antibody sandwich ELISA based on the porcine circovirus type 2 (PCV2) propagated in cell culture for antibody detection / Sandwich ELISA com duplo anticorpo baseado no circovirus suíno tipo 2 (PCV2) produzido em cultivo celular para detecção de anticorpos

Few studies have described enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of antibodies against porcine circovirus type 2 (PCV2) based on antigens produced in cell culture. Furthermore, few articles have described viral purification techniques for members of the family Circoviridae. This occurs because circoviruses are difficult to isolate, noncytopathogenic, and produce low viral titres in cell culture. Thus, for overcoming these difficulties in the cultivation of PCV2, this study aimed to develop a double-antibody sandwich ELISA based on the cell culture antigen PCV2b for the quantification of anti-PCV2 antibodies. A 20% and 50% discontinuous sucrose cushion was used for viral purification, which enabled the separation of cell culture proteins in the 20% sucrose cushion and a greater viral concentration in the 50% sucrose cushion. Following isopycnic centrifugation, PCV2 was concentrated in the band with density values from 1.330 to 1.395g/cm3. Viral purification was assessed using SDS-PAGE, indirect ELISA and electron microscopy. The standardised ELISA revealed a strong linear correlation (r= 0.826, p<0.001) when compared with a commercial ELISA kit. The assay exhibited low variability (inter-assay coefficient of variation of 4.24% and intra-assay of 1.80%) and excellent analytical specificity conferred by the capture antibody produced in rabbit. Thus, this ELISA is a rapid, specific and convenient method for the detection of antibodies against PCV2 in studies of experimental and natural infection, and in monitoring the response to vaccination on commercial farms.(AU)

Há poucos relatos na literatura de métodos de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), para a detecção de anticorpos contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), baseados em antígenos produzidos em cultivo celular, bem como uma escassez de trabalhos descrevendo técnicas de purificação viral para os membros da família Circoviridae. Isso ocorre, pois os circovírus são de difícil isolamento, não causam efeito citopático e produzem um baixo título viral em cultivo celular. Assim, para superar essas dificuldades encontradas no cultivo do PCV2, este estudo objetivou desenvolver um sandwich ELISA com duplo anticorpo, baseado no antígeno de PCV2 produzido em cultivo celular, para a quantificação de anticorpos anti-PCV2. Um colchão de sacarose descontínuo a 20% e 50% foi utilizado para a purificação viral, o qual possibilitou a separação das proteínas oriundas do cultivo celular no colchão de sacarose a 20% e uma maior concentração viral no colchão de sacarose a 50%. Com a ultracentrifugação isopícnica, o PCV2 ficou mais concentrado na banda com valores de densidade de 1,330 a 1,395g/cm3. A purificação viral foi avaliada pelas técnicas de SDS-PAGE, ELISA indireto e microscopia eletrônica. Assim, o método de ELISA padronizado revelou uma forte correlação linear (r = 0,826, p <0,001) quando comparado com um kit de ELISA comercial. O ensaio demonstrou baixa variabilidade (coeficientes de variação inter-teste de 4,24% e intra-teste de 1,80%) e uma excelente especificidade analítica conferida pelo anticorpo de captura produzido em coelho. Portanto, o método de ELISA demonstrou ser rápido, específico e conveniente para a detecção de anticorpos contra o PCV2 em estudos de infecção natural e experimental, além da monitoria da resposta à vacinação contra o PCV2 em granjas comerciais.(AU)

Equine influenza in Brazil / A influenza equina no Brasil

Equine influenza virus (EIV) (H3N8 and H7N7) is the causative agent of equine influenza, or equine flu. The H7N7 subtype has been considered to be extinct worldwide since 1980. Affected animals have respiratory symptoms that can be worsened by secondary bacterial respiratory infection, thereby leading to great economic losses in the horse-breeding industry. In Brazil, equine influenza outbreaks were first reported in 1963 and studies on hemagglutination antibodies against viral subtypes in Brazilian horses have been conducted since then. The objective of the present review was to present the history of the emergence of EIV around the world and in Brazil and the studies that have thus far been developed on EIV in Brazilian equines...

O vírus da influenza equina (EIV) (H3N8 e H7N7) é o agente causador da influenza equina, ou gripe equina. O subtipo viral H7N7 é considerado como mundialmente extinto desde 1980. Os animais afetados têm sintomas respiratórios característicos que podem ser agravados por uma infecção respiratória bacteriana secundária causando grandes prejuízos no ramo equestre. No Brasil, os surtos da EI têm sido relatados desde 1963 e desde então vem sendo efetuados estudos sobre a presença de anticorpos hemaglutinantes contra os subtipos virais nos equídeos brasileiros. O presente artigo tem o objetivo de apresentar um histórico sobre o surgimento do EIV no mundo e no Brasil destacando os estudos conduzidos no Brasil até o momento acerca da infecção pelo EIV nos equídeos brasileiros...

Molecular characterization of Brazilian equid herpesvirus type 1 strains based on neuropathogenicity markers

Partial nucleotide sequences of ORF72 (glycoprotein D, gD), ORF64 (infected cell protein 4, ICP4) and ORF30 (DNA polymerase) genes were compared with corresponding sequences of EHV-1 reference strains to characterize the molecular variability of Brazilian strains. Virus isolation assays were applied to 74 samples including visceral tissue, total blood, cerebrospinal fluid (CSF) and nasal swabs of specimens from a total of 64 animals. Only one CSF sample (Iso07/05 strain) was positive by virus isolation in cell culture. EHV-1 Iso07/05 neurologic strain and two abortion visceral tissues samples (Iso11/06 and Iso33/06) were PCR-positive for ORF33 (glycoprotein B, gB) gene of EHV-1. A sequence analysis of the ORF72, ORF64 and ORF30 genes from three EHV-1 archival strains (A3/97, A4/72, A9/92) and three clinical samples (Iso07/05, Iso11/06 and Iso33/06) suggested that among Brazilian EHV-1 strains, the amplified region of the gD gene sequence is highly conserved. Additionally, the analysis of ICP4 gene showed high nucleotide and amino acid identities when compared with genotype P strains, suggesting that the EHV-1 Brazilian strains belonged to the same group. All the EHV-1 Brazilian strains were classified as non-neuropathogenic variants (N752) based on the ORF30 analysis. These findings indicate a high conservation of the gD-, ICP4- and ORF30-encoding sequences. Different pathotypes of the EHV-1 strain might share identical genes with no specific markers, and tissue tropism is not completely dependent on the gD envelope, immediate-early ICP4 and DNA polymerase proteins.

In vitro interaction of bovine herpesvirus 1 with uterine tube epithelial cells and oocytes / Interação in vitro do herpesvírus bovino tipo 1 com células epiteliais da tuba uterina e oócitos

The aims of this study were to assess in vitro if bovine oocytes and oviductal epithelial cells from slaughterhouses for in vitro fertilization use may be infected with bovine herpesvirus 1; to analyze whether the treatment with trypsin according to the International Embryo Transfer Society guideline is efficient to inactivate the bovine herpesvirus 1; to morphologically study the virus-oocyte interaction through optical microscopy. In this study, Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) cells that were co-cultured with oocytes matured in vitro and exposed to bovine herpesvirus 1 showed a cytopathic effect. The nested polymerase chain reaction for the supernatant was positive for the bovine herpesvirus 1, thus suggesting that the cytopathic effect observed in the MDBK monolayer was seen due to virus replication and not because of any culture toxicity. It was also observed cytopathic effect and positive nested polymerase chain reaction in MDBK cells co-cultured with in vitro maturated oocytes free of virus, but that were co-cultured in uterine epithelial cells pre-infected with bovine herpesvirus 1 and washed or not with trypsin, demonstrating an oocyte contamination by the virus. When trypsin-washing efficacy was evaluated, we could observe that the trypsin treatment was not able to eliminate the bovine herpesvirus 1 of the oocytes, and it was not observed any morphological difference in the infected oocytes.(AU)

Os objetivos do presente estudo foram avaliar in vitro se oócitos bovinos e células epiteliais de oviduto provenientes de abatedouros para uso em fertilização in vitro podem ser infectados com o herpesvírus bovino tipo 1; analisar se o tratamento com tripsina padronizado pelo International Embryo Transfer Society é eficiente para inativar o herpesvírus bovino tipo 1; estudar morfologicamente a interação vírus e oócito pela microscopia óptica. Neste estudo, as células Madin Darby Bovine Kidney (MDBK), que foram cocultivadas com oócitos maturados in vitro e expostos ao herpesvírus bovino tipo 1, apresentaram efeito citopático. A reação em cadeia da polimerase aninhada ao sobrenadante foi positiva para o herpesvírus bovino tipo 1, sugerindo que o efeito citopático observado na monocamada MDBK foi em função da replicação do vírus, mas não devido a qualquer toxicidade da cultura. Também foram mostrados efeito citopático e reação em cadeia da polimerase aninhada positivos em células MDBK cocultivadas com oócitos maturados in vitro isentos de vírus, porém que foram cocultivados em células epiteliais uterinas previamente infectadas com herpesvírus bovino tipo 1, que se lavou ou não com tripsina, demonstrando uma contaminação pelo vírus do oócito. Quando foi avaliada a eficácia de lavagem com a tripsina, foi possível notar que este tratamento não foi capaz de eliminar o herpesvírus bovino tipo 1 dos oócitos, e não foi observada qualquer diferença morfológica nos oócitos infectados.(AU)

Phylogenetic analysis of rabies virus isolated from herbivores in Minas Gerais and São Paulo border (2000-2009), Brazil / Análise filogenética de isolados do vírus da raiva de herbívoros na fronteira de Minas Gerais e São Paulo (2000-2009), Brasil

Rabies transmitted by the hematophagous bat Desmodus rotundus represents a public health concern and a burden for the Brazilian livestock industry. Current evidence suggests that rabies occurrence is related to landscape characteristics, topography, hydrography, animal production systems and land use...

A raiva transmitida por morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus representa uma preocupação de saúde pública e causa de importantes prejuízos para a pecuária brasileira. A evidência atual sugere que a ocorrência de raiva está relacionada às características da paisagem, topografia, hidrografia, sistemas de produção animal e usos da terra...

Presence of resiiratory viruses in equines in Brazil / Presença de vírus respiratórios em equinos do Brasil

Equines are susceptible to respiratory viruses such as influenza and parainfluenza. Respiratory diseases have adversely impacted economies all over the world. This study was intended to determine the presence of influenza and parainfluenza viruses in unvaccinated horses from some regions of the state of São Paulo, Brazil. Blood serum collected from 72 equines of different towns in this state was tested by hemagglutination inhibition test to detect antibodies for both viruses using the corresponding antigens. About 98.6% (71) and 97.2% (70) of the equines responded with antibody protective titers (≥ 80 HIU/25µL) H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A viruses, respectively. All horses (72) also responded with protective titers (≥ 80) HIU/25µL against the parainfluenza virus. The difference between mean antibody titers to H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A viruses was not statistically significant (p > 0.05). The mean titers for influenza and parainfluenza viruses, on the other hand, showed a statistically significant difference (p < 0.001). These results indicate a better antibody response from equines to parainfluenza 3 virus than to the equine influenza viruses. No statistically significant differences in the responses against H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A and parainfluenza 3 viruses were observed according to the gender (female, male) or the age (≤ 2 to 20 years-old) groups. This study provides evidence of the concomitant presence of two subtypes of the equine influenza A (H7N7 and H3N8) viruses and the parainfluenza 3 virus in equines in Brazil. Thus, it is advisable to vaccinate equines against these respiratory viruses.

Os equinos são susceptíveis aos vírus respiratórios, como o vírus influenza, e também tem sido citado o vírus parainfluenza. Doenças respiratórias têm impactado a economia em todo mundo. Este estudo intencionou determinar a presença dos vírus influenza e parainfluenza em equinos não vacinados de certas regiões do Estado de São Paulo, Brasil. Os soros coletados de 72 equinos, de diferentes cidades deste Estado, foram submetidos ao teste de Inibição da Hemaglutinação (IH) com objetivo de detectar anticorpos contra os referidos vírus, usando antígenos correspondentes. Cerca de 98,8% (72) e 97,2% (70) desses equinos responderam com títulos protetores (≥ 80 UIH/25µL) para os subtipos H7N7 e H3N8 de vírus influenza, respectivamente. Todos equinos (72) responderam com títulos protetores (≥ 80 UIH/25µL) contra o vírus parainfluenza 3. A diferença entre as médias de anticorpos contra o vírus influenza A não foi estatisticamente significante (p > 0,05). As médias de títulos dos vírus influenza e parainfluenza, por outro lado, demonstraram diferença estatisticamente significante (p < 0,001). Esses resultados indicam melhor resposta de anticorpos pelos equinos ao vírus parainfluenza 3 do que ao vírus da influenza equina. Nenhuma diferença estatística foi observada nas respostas contra os vírus da influenza equina A (H7N7 e H3N8) e parainfluenza 3, com relação ao gênero (fêmeas e machos) e grupo etário (≤ 2 até 20 anos) nos equinos avaliados. Este estudo fornece evidência da presença concomitante dos dois subtipos vírus influenza A (H7N7 e H3N8) e do parainfluenza 3 em cavalos no Brasil. Portanto, é aconselhável a vacinação dos cavalos contra esses vírus respiratórios.

Molecular epidemiology of rabies virus isolated of herbivores from Brazilian Amazon / Epidemiologia molecular de vírus da raiva isolados de herbívoros procedentes da Amazônia brasileira

Rabies virus samples (n = 17) A1 to A3 exhibit a similar composition and geographic distribution. Diverse composition of remaining groups of N and G gene is attributable to different sequences used in the alignments for each genomic region. Glycoprotein amino acid sequence showed molecular markers in sub-lineages A2, A3, A4 and A7. This information provides a better comprehension of molecular epidemiology of rabies, starting with the knowledge of viral lineages circulating in the Brazilian Amazon.

Amostras do vírus da raiva (n = 17) isoladas de bovinos (n = 11), equinos (n = 4) e bubalinos (n = 2) procedentes do Pará (n = 7), Tocantins (n = 6) e Rondônia (n = 4) foram submetidas à técnica de RT-PCR para amplificação parcial dos genes da Nucleoproteína (N) e Glicoproteína (G). As sequências nucleotídicas obtidas foram analisadas pelo método de reconstrução filogenética Neighbor-Joining com o modelo evolutivo Kimura 2-parâmetros. Todas as 17 amostras pertenceram ao cluster A, que se encontrou na linhagem associado com morcego hematófago Desmodus rotundus. A análise filogenética baseada nos genes N e G, sugere a presença de cinco sublinhagens (A1-A5) e sete sublinhagens (A1-A7), respectivamente. Quando se compara ambas as filogenias, as sublinhagens A1 até A3 mostram composição e distribuição geográfica concordante, já a diversidade observada na composição das sublinhagens restantes é atribuída ao uso de sequências de diferentes alinhamentos. A glicoproteína mostrou marcadores moleculares nas sublinhagens A2, A3, A4 e A7, o que fornece elementos para melhor compreensão da epidemiologia molecular da raiva das linhagens circulantes na Amazônia Brasileira.

Canine distemper virus infection in a lesser grison (Galictis cuja): first report and virus phylogeny / Infecção pelo vírus da cinomose canina em um furão (Galictis cuja): primeiro relato e filogenia viral

Infectious diseases in wild animals have been increasing as a result of their habitat alterations and closer contact with domestic animals. Canine distemper virus (CDV) has been reported in several species of wild carnivores, presenting a threat to wildlife conservation. We described the first case of canine distemper virus infection in lesser grison (Galictis cuja). A free-ranging individual, with no visible clinical sigs, presented sudden death after one day in captivity. Molecular diagnosis for CDV infection was performed using whole blood collected by postmortem intracardiac puncture, which resulted positive. The virus phylogeny indicated that domestic dogs were the probable source of infection.

Doenças infecciosas em animais selvagens têm aumentado devido às alterações em seu habitat e ao maior contato com animais domésticos. A cinomose já foi descrita em diversas espécies de carnívoros selvagens, representando uma ameaça à conservação da vida selvagem. Nesse estudo é descrito o primeiro caso de infecção pelo vírus da cinomose em um furão (Galictis cuja). Um indivíduo de vida livre, sem sinais clínicos aparentes, apresentou morte súbita após um dia em cativeiro. Foi realizado o diagnóstico molecular para detecção do vírus da cinomose canina, sendo o resultado positivo. A filogenia do vírus indicou que cães domésticos foram a provável fonte de infecção.

Spotted fever group Rickettsia infecting ticks (Acari: Ixodidae) in the state of Santa Catarina, Brazil

During 2006-2008, a total of 260 adult ticks were collected from domestic and wild animals in different regions of the state of Santa Catarina (SC), Brazil, including areas where human cases of Brazilian spotted fever have been reported. Collected ticks belonging to nine species (Amblyomma aureolatum, Amblyomma cajennense, Amblyomma dubitatum, Amblyomma longirostre, Amblyomma ovale, Amblyomma tigrinum, Dermacentor nitens, Rhipicephalus microplus and Rhipicephalus sanguineus) were tested by polymerase chain reaction (PCR) for rickettsial infection. Overall, eight (3.1 percent) ticks were found to be infected with Rickettsia species. After sequencing the PCR products, we determined that the sequences generated from three A. aureolatum, one A. ovale and one R. sanguineus from the municipality of Blumenau, one A. ovale from the municipality of Águas Mornas and one A. ovale from the municipality of Urussanga were identical to the corresponding partial rickettsial ompA gene sequence of Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. The sequence generated from one A. longirostre from Blumenau was 100 percent identical to the corresponding partial rickettsial ompA gene sequence of Rickettsia amblyommii strain AL. Because R. parkeri strain Atlantic rainforest was recently shown to have caused two cases of human spotted fever in other states of Brazil, the role of this rickettsial agent as a possible etiological agent of spotted fever in SC is discussed.

A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin-esterase gene of Bovine Coronavirus / Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino

Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.

Occurrence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. isolated from domestic animals in a rural area surrounding Atlantic dry forest fragments in Teodoro Sampaio municipality, State of São Paulo, Brazil / Ocorrência e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. isolados de animais domésticos de propriedades rurais circunvizinhas a fragmentos de Floresta Atlântica Seca do Estado de São Paulo, Brasil

The aim of this study was to assess the occurrence of Cryptosporidium in domestic animals in rural properties surrounding rain forest fragments within the municipality of Teodoro Sampaio, southeastern Brazil. Conventional sucrose flotation method followed by molecular characterization of the parasites by sequencing PCR products amplified from SSU rRNA gene were used. Stool samples were collected from domestic animals raised as pets and livestock in all rural properties surrounding three forest fragments. Samples from cattle (197), equine (63), pigs (25), sheep (11), and dogs (28) were collected from 98 rural properties. The frequency of occurrence of Cryptosporidium within each animal species was 3.0 percent (6/197) among cattle and 10.7 percent (3/28) among dogs. Cryptosporidium was not detected in stool samples from equine, sheep, and pigs. All sequences obtained from the six samples of calves showed molecular identity with Cryptosporidium andersoni while all sequences from dog samples were similar to C. canis. The frequency of occurrence of Cryptosporidium in these domestic animal species was low. The absence of C. parvum in the present study suggests that the zoonotic cycle of cryptosporidiosis may not be relevant in the region studied. The presence of Cryptosporidium species seldom described in humans may be, otherwise, important for the wild fauna as these animals are a source of infection and dissemination of this protozoan to other animal species. The impact and magnitude of infection by C. andersoni in wild ruminants and C. canis in wild canids have to be assessed in future studies to better understand the actual importance of these species in this region.

O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de Cryptosporidium, em animais domésticos de propriedades rurais ao redor de fragmentos de mata Atlântica de interior no município de Teodoro Sampaio, por exame convencional de flutuação em solução de sacarose, seguido de caracterização molecular dos parasitas através do sequenciamento dos produtos amplificados na PCR do gene SSU rRNA. Foram coletadas amostras fecais de animais domésticos criados para subsistência e estimação nas propriedades rurais do entorno de três fragmentos florestais. Amostras de bovinos (197), equinos (63), suínos (25), ovinos (11) e cães (28) foram coletadas de 98 propriedades rurais. A ocorrência de Cryptosporidium para a espécie bovina foi de 3,0 por cento (6/197); para os cães, de 10,7 por cento (3/28); e para os demais animais os resultados foram negativos. Todas as sequências obtidas das seis amostras de bovinos apresentaram identidade molecular com Cryptosporidium andersoni, enquanto as sequências oriundas de amostras de fezes de cães revelaram-se similares ao C. canis. A ocorrência do Cryptosporidium entre os animais estudados foi baixa. Diante dos resultados do presente estudo, o ciclo zoonótico da criptosporidiose parece ter menos importância nesta região. A presença de espécies de Cryptosporidium ainda pouco relatadas em humanos pode ser, por outro lado, importante para a fauna silvestre, uma vez que estes animais podem ser considerados como uma fonte de infecção e disseminação deste protozoário. O impacto e a magnitude da infecção de C. andersoni, em ruminantes selvagens, e de C. canis, em cães silvestres, deve ser avaliado em estudos futuros, com intuito de verificar a real importância dessas espécies nesta região.

Differentiation of Bovine coronavirus (BCoV) genotypes by a restriction enzyme assay

This article reports the use of the GsuI restriction enzyme to differentiate genotypes of Bovine Coronavirus (BCoV), based on an 18-nucleotide deletion of S1-coding region found in one of the two genotypes. It was concluded that this assay can be used as a rapid tool for BCoV genotypes differentiation.

Rickettsia felis infection in cat fleas Ctenocephalides felis felis

The present study evaluated the rickettsial infection in a laboratory colony of cat fleas, Ctenocephalides felis felis (Bouche) in Brazil. All flea samples (30 eggs, 30 larvae, 30 cocoons, 30 males, and 30 females) tested by polymerase chain reaction (PCR) were shown to contain rickettsial DNA. PCR products, corresponding to the rickettsial gltA, htrA, ompA and ompB gene partial sequences were sequenced and showed to correspond to Rickettsia felis, indicating that the flea colony was 100 percent infected by R. felis. The immunofluorescence assay (IFA) showed the presence of R. felis-reactive antibodies in blood sera of 7 (87.5 percent) out of 8 cats that were regularly used to feed the flea colony. From 15 humans that used to work with the flea colony in the laboratory, 6 (40.0 percent) reacted positively to R. felis by IFA. Reactive feline and human sera showed low endpoint titers against R. felis, varying from 64 to 256. With the exception of one human serum, all R. felis-reactive sera were also reactive to Rickettsia rickettsii and/or Rickettsia parkeri antigens at similar titers to R. felis. The single human serum that was reactive solely to R. felis had an endpoint titer of 256, indicating that this person was infected by R. felis.

The cap gene of porcine circovirus type 2 (PCV2) evolves by positive selection in vitro / O gene cap de circovírus suíno tipo 2 (PCV2) evolui por seleção positiva in vitro

This article reports the genetic divergence of PCV2 after passages in VERO and SK-RST cell lines. Fisher’s exact test indicated a trend for positive selection on the cap gene. These results allow insights on the development of PCV2 vaccines and the evolution of the genus Circovirus.

Este artigo relata a divergência genética de PCV2 após passagens em células das linhagens VERO e SK-RST. O teste exato de Fisher indicou tendência para seleção positiva no gene cap. Estes resultados permitem inferências relativas ao desenvolvimento de vacinas contra PCV2 e sobre a evolução do gênero Circovirus.

Etiologic diagnosis of bovine infectious abortion by PCR / Diagnóstico etiológico de aborto infeccioso bovino por PCR

Infectious abortion is a significant cause of reproductive failure and economic losses in cattle. The goal of this study was to detect nucleic acids of several infectious agents known to cause abortion including Arcanobacterium pyogenes, Bovine Herpesvirus 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum, and Tritrichomonas foetus. Tissue homogenates from 42 fetuses and paraffin-embedded tissues from 28 fetuses and 14 placentas/endometrium were included in this study. Brucella abortus was detected in 14.2 percent (12/84) of the samples. Salmonella sp. DNA was amplified from 2 fetuses, and there was one positive for Neospora caninum, and another for Listeria monocytogenes. This PCR-based approach resulted in identification of the etiology in 19 percent of samples, or 20 percent if considered fetal tissues only.

Aborto infeccioso é uma causa significativa de falhas reprodutivas e perdas econômicas na bovinocultura. O objetivo deste estudo foi detectar ácidos nucleicos de vários agentes infecciosos reconhecidos como causadores de aborto, incluindo-se Arcanobacterium pyogenes, Herpesvirus bovino tipo 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum e Tritrichomonas foetus. Homogenados de tecidos de 42 fetos e tecidos incluídos em parafina de 28 fetos e 14 placentas/endométrio foram incluídos neste estudo. Brucella abortus foi detectada em 14,2 por cento (12/84) das amostras. DNA de Salmonella sp. foi amplificado de dois fetos e houve um feto positivo para Neospora caninum e outro para Listeria monocytogenes. Essa metodologia baseada em PCR resultou na identificação da etiologia em 19 por cento das amostras ou 20 por cento se considerados somente os tecidos fetais.

Rapid detection of bovine coronavirus by a semi-nested RT-PCR / Detecção rápida do Coronavírus Bovino (BCoV) por meio de uma semi-nested RT-PCR

Bovine coronavirus (BCoV) is a member of the group 2 of the Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) and the causative agent of enteritis in both calves and adult bovine, as well as respiratory disease in calves. The present study aimed to develop a semi-nested RT-PCR for the detection of BCoV based on representative up-to-date sequences of the nucleocapsid gene, a conserved region of coronavirus genome. Three primers were designed, the first round with a 463bp and the second (semi-nested) with a 306bp predicted fragment. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titre: 256) in DEPC treated ultra-pure water, in fetal bovine serum (FBS) and in a BCoV-free fecal suspension, when positive results were found up to the 10-2, 10-3 and 10-7 dilutions, respectively, which suggests that the total amount of RNA in the sample influence the precipitation of pellets by the method of extraction used. When fecal samples was used, a large quantity of total RNA serves as carrier of BCoV RNA, demonstrating a high analytical sensitivity and lack of possible substances inhibiting the PCR. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 25 fecal samples from adult cows, previously tested by a nested RT-PCR RdRp used as a reference test, resulting in 20 and 17 positives for the first and second tests, respectively, and a substantial agreement was found by kappa statistics (0.694). The high sensitivity and specificity of the new proposed method and the fact that primers were designed based on current BCoV sequences give basis to a more accurate diagnosis of BCoV-caused diseases, as well as to further insights on protocols for the detection of other Coronavirus representatives of both Animal and Public Health importance.

O Coronavírus bovino (BCoV) pertence ao grupo 2 do gênero Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) e é agente causador de enterites tanto em bezerros como em bovinos adultos, bem como de doença respiratória em bezerros. O presente estudo teve por objetivo desenvolver uma semi-nested RT-PCR para a detecção do BCoV com base em seqüências representativas e recentes do gene do nucleocapsídeo, região conservada do genoma dos coronavírus. Três primers foram desenhados, a primeira amplificação com um fragmento esperado de 463pb e a segunda (semi-nested) com um fragmento esperado de 306pb. A sensibilidade analítica foi determinada pela diluição do BCoV cepa Kakegawa (título HA: 256) na base de 10 em água ultra-pura tratada com DEPC, em soro fetal bovino (SFB) e em uma suspensão fecal negativa para o BCoV, onde foram encontrados resultados positivos até a diluição de 10-2, 10-3 e 10-7, respectivamente. Este resultado sugere que a quantidade total de RNA na amostra influencia na precipitação dos pellets pelo método de extração utilizado. Quando se utiliza amostra fecal, a grande quantidade de RNA total funciona como carreadora do RNA do BCoV, demonstrando elevada sensibilidade analítica e ausência de possíveis substâncias inibidoras da PCR. O protocolo final da semi-nested RT-PCR foi aplicado a 25 amostras fecais de vacas adultas, previamente avaliadas por uma nested RT-PCR RdRp utilizada como teste de referência, resultando em 20 e 17 amostras positivas para o primeiro e segundo teste, respectivamente. Os resultados dos dois sistema de diagnóstico apresentaram concordância substancial (kappa: 0,694). A elevada sensibilidade e especificidade do novo método proposto e o fato de que os primers foram desenhados baseados em sequências atuais do BCoV, oferecem bases para o diagnóstico mais acurado de infecções causadas pelo BCoV, assim como para novas perspectivas em protocolos de detecção de outros Coronavírus de importância tanto em saninade animal ...